此前，為大家簡述了氣相色譜中的“溶劑效應(yīng)。而高效液相色譜分析作為現(xiàn)代藥物分析的重要手段，在日常實(shí)驗(yàn)中，分析工作者通常將注意力集中在流動(dòng)相和色譜柱以及儀器方法的選擇上。故而當(dāng)出現(xiàn)異常峰形時(shí)，分析工作者往往會忽略溶解樣品所用的溶劑不恰當(dāng)也是成因之一。所以一招“借刀殺人”，就讓各種色譜耗材為不合適的溶劑背了鍋。

溶劑效應(yīng)的概念

通常情況下我們認(rèn)為的“溶劑效應(yīng)”是樣品溶劑強(qiáng)度大于流動(dòng)相強(qiáng)度時(shí)造成的色譜峰變形的現(xiàn)象。但我們會發(fā)現(xiàn)，有時(shí)我們的樣品溶劑的強(qiáng)度并未大于流動(dòng)相，但由于加入了某些稀釋劑，使得峰形變形情況依舊出現(xiàn)。因此廣義上對“溶劑效應(yīng)”的概念應(yīng)擴(kuò)展為由于樣品中某些組分在稀釋劑與流動(dòng)相中的存在狀態(tài)有較大差異，導(dǎo)致色譜行為表現(xiàn)異常的情況。

溶劑效應(yīng)的成因

01 溶劑強(qiáng)度

這便是普遍意義上的“溶劑效應(yīng)”成因，如當(dāng)流動(dòng)相組成為低比例的乙腈水溶液，而樣品溶劑為純乙腈時(shí)，會由于溶劑的強(qiáng)度大于流動(dòng)相而產(chǎn)生峰分叉或峰拖尾。

02 進(jìn)樣體積

當(dāng)進(jìn)樣體積較小時(shí)，擴(kuò)散至流動(dòng)相中的溶質(zhì)占大多數(shù)，且擴(kuò)散在很短時(shí)間內(nèi)完成，因此峰形與用流動(dòng)相直接溶解樣品無大差異。隨著進(jìn)樣的體積增大，留在溶劑本身里的溶質(zhì)的量逐漸增大，當(dāng)進(jìn)樣體積增大到一定數(shù)量，留在溶劑里的溶質(zhì)的量變得不可忽略，在色譜圖上就表現(xiàn)為色譜峰的分叉、拖尾等。

03 溶劑兼容性

有時(shí)，當(dāng)我們使用流動(dòng)相或流動(dòng)相中的有機(jī)相無法直接溶解樣品，這時(shí)很多小伙伴會選擇使用氯仿、甲苯等能溶的溶劑，甚至DMSO這樣的“萬能溶劑”來溶解樣品。這樣進(jìn)樣的結(jié)果是溶劑與流動(dòng)相不兼容，溶質(zhì)難以在流動(dòng)相中擴(kuò)散。又如，在做參比制劑的溶出曲線中，溶媒中經(jīng)常加入表面活性劑。而帶有表面活性劑的溶劑進(jìn)樣后，由于溶質(zhì)在含有表面活性劑的溶劑中的分配系數(shù)與在流動(dòng)相中的分配系數(shù)存在較大差異，就會導(dǎo)致峰形的問題，甚至保留時(shí)間的漂移。

04 電離狀態(tài)

電離狀態(tài)的差異主要由溶劑和流動(dòng)相各自的pH差異引起。我們都知道，在反相體系中，目標(biāo)化合物的存在狀態(tài)不同，保留行為會有明顯的差異，而存在狀態(tài)就取決于目標(biāo)化合物在不同pH體系內(nèi)的電離狀態(tài)。若樣品在溶劑和流動(dòng)相中電離狀態(tài)差異較大，樣品溶液在接觸流動(dòng)相的過程中，來不及緩沖至流動(dòng)相中的電離狀態(tài)，是個(gè)時(shí)間如果較長，就容易表現(xiàn)為保留時(shí)間發(fā)生錯(cuò)位或峰形變形，如下圖的案例。

（流動(dòng)相為pH 3.0緩沖鹽。綠色譜圖為對照品，另外三個(gè)譜圖樣品的溶劑從下至上分別為0.1%磷酸、純化水、pH 3.0流動(dòng)相）

溶劑效應(yīng)的解決

01 溶劑強(qiáng)度

對于這一Z普遍的溶劑效應(yīng)，解決辦法即調(diào)整稀釋劑或流動(dòng)相，使二者洗脫能力接近，或稀釋劑洗脫能力稍低于流動(dòng)相都是可以的。一般情況下，為避免溶劑強(qiáng)度差異導(dǎo)致的溶劑效應(yīng)，反相色譜中較為穩(wěn)妥的做法是稀釋劑中有機(jī)相比例和流動(dòng)相相當(dāng)，必要時(shí)可略高于流動(dòng)相，但應(yīng)當(dāng)據(jù)其評估其溶劑效應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)。

02 進(jìn)樣體積

常規(guī)情況下，為了保證峰形，我們的進(jìn)樣體積都控制在5-20μL，盡量不要超過25μL。如果不能做到減少至合適的進(jìn)樣體積，為了得到較好的峰形，應(yīng)盡量選擇與流動(dòng)相比例相同或接近的溶劑。

03 溶劑兼容性

使得溶劑與流動(dòng)相能較好地兼容，目前辦法有兩個(gè)：

一、若流動(dòng)相或流動(dòng)相中的有機(jī)相無法直接溶解樣品，則用可以溶解樣品的溶劑溶解成高濃度儲備液，然后用流動(dòng)相稀釋至所需濃度；

二、在流動(dòng)相中加入同樣的助溶劑或表面活性劑，或提高有機(jī)相的比例。

04 電離狀態(tài)

電離狀態(tài)的差異許多情況下會表現(xiàn)為保留時(shí)間的漂移或不穩(wěn)定?？梢酝ㄟ^將樣品溶液的pH調(diào)節(jié)至與流動(dòng)相一致，或增大流動(dòng)相的緩沖能力來改善。

以上便是小編為大家總結(jié)的高效液相色譜“溶劑效應(yīng)”的原理及解決辦法。高效液相色譜進(jìn)樣前，必須選擇一種合適的溶劑體系。若溶劑選擇不當(dāng)會使得峰形發(fā)生不同程度的異常，進(jìn)而影響分析結(jié)果。